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Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 583 (2023) Citare questo articolo

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La capacità di acquisire immagini della chimica cellulare su scala nanometrica è fondamentale per comprendere la biologia cellulare, ma molte microscopie ottiche sono limitate dal limite di diffrazione di ~ (200–250) nm. La microscopia elettronica e le tecniche di fluorescenza a super risoluzione superano questo limite, ma si affidano alla colorazione e all'etichettatura specializzata per generare il contrasto dell'immagine. È difficile, quindi, ottenere informazioni sulla chimica funzionale dei componenti intracellulari. Qui dimostriamo una tecnica per la mappatura chimica intracellulare senza etichetta con risoluzione su scala nanometrica (~ 30 nm). Utilizziamo un microscopio ottico basato su sonda illuminato con un laser nel medio infrarosso le cui lunghezze d'onda eccitano le modalità vibrazionali dei gruppi funzionali che si verificano all'interno delle molecole biologiche. A titolo dimostrativo, mappiamo chimicamente le strutture intracellulari nelle cellule di mieloma multiplo umano e confrontiamo le morfologie con micrografie elettroniche della stessa linea cellulare. Dimostriamo anche la mappatura senza etichetta a lunghezze d'onda scelte per individuare le firme chimiche di proteine ​​e acidi nucleici, in un modo che può essere utilizzato per identificare marcatori biochimici nello studio di malattie e farmacologia.

Il percorso standard verso la conoscenza ultrastrutturale, la microscopia elettronica (EM), utilizza campioni colorati con metalli pesanti per generare contrasto di assorbimento degli elettroni e conduttività elettrica. Sono generalmente incorporati in resina per resistere al bombardamento di elettroni nel vuoto in un processo che richiede diversi giorni. Inoltre, in assenza di un'immunomarcatura molto specifica, le immagini EM forniscono solo informazioni morfologiche e rivelano solo caratteristiche ultrastrutturali che prendono la colorazione.

Una varietà di microscopie a fluorescenza a super risoluzione consentono anche l'imaging a sub-diffrazione delle strutture cellulari1,2, ma tutte richiedono etichette specifiche per il problema in questione e spesso si basano sulla conoscenza a priori delle strutture per un'etichettatura efficace. In pratica, il fotosbiancamento dei fluorofori, così come i problemi di stabilità e specificità, limitano la precisione con cui le etichette possono essere localizzate. Anche se tali sfide tecniche vengono superate, la capacità di localizzare le strutture è limitata dalla distanza tra la struttura bersaglio e il fluoroforo, determinata dalla lunghezza delle etichette fluorescenti e dalle molecole di collegamento utilizzate, che in genere sono di diversi nanometri ciascuna3. Fondamentalmente, esiste anche il rischio che l'etichettatura perturbi la biologia dei campioni1.

La spettroscopia e l'imaging a infrarossi (IR) sono ampiamente utilizzate per ottenere informazioni chimiche quantitative prive di etichetta, ma il limite di diffrazione generalmente la rende incapace di imaging a livello intracellulare. Per superare questo limite, sono state sviluppate diverse tecniche di imaging basate su sonde che combinano il potere risolutivo su scala nanometrica della microscopia a forza atomica (AFM) con la sensibilità chimica della spettroscopia IR4,5. Utilizziamo la microscopia ottica a scansione in campo vicino di tipo scattering (s-SNOM), in cui la sonda AFM è illuminata da un laser IR sintonizzabile. La raccolta e l'analisi della luce IR retrodiffusa dalla piccola regione in cui interagiscono la punta e il campione ci consente di dedurre le proprietà di assorbimento IR del materiale campione in quella regione. La regolazione del laser ci consente di ottenere immagini con specificità chimica senza la necessità di colorazione o etichettatura. È importante sottolineare che immaginiamo il materiale biologico stesso. Rileviamo caratteristiche ultrastrutturali che non sono mai state riprese direttamente con la luce, aumentando la possibilità di trovare nuove strutture intracellulari che non sono visibili nell'EM.

s-SNOM è stato precedentemente utilizzato per l'imaging di campioni biologici isolati come complessi proteici6,7,8, virus9 e fibrille amiloidi10, nonché per l'imaging superficiale di cellule intere11,12,13. Le strutture intracellulari nelle cellule e nei tessuti sono state fotografate anche negli organismi unicellulari14 e nel tessuto retinale del pesce zebra15, rispettivamente. Qui ci basiamo su questo mappando chimicamente le strutture intracellulari nelle cellule di mieloma multiplo umano, comprese, a conoscenza degli autori, le prime immagini direttamente ottiche e sub-diffrazione del reticolo endoplasmatico (ER), dei mitocondri (Mt) e dei componenti fibrillari nei nucleoli. Variando la lunghezza d'onda dell'illuminazione per colpire diversi gruppi chimici nelle cellule, dimostriamo anche l'isolamento dell'ultrastruttura in un modo tradizionalmente ottenuto solo con un'etichettatura altamente specifica.